非洲豬瘟試劑盒使用說明書

非洲豬瘟試劑盒又稱非洲豬瘟核酸病毒熒光PCR試劑盒，非洲(zhou)豬瘟試劑(ji)盒(he)利用(yong)實(shi)時熒光定(ding)量(liang)PCR原理(li)，可用(yong)于(yu)檢測(ce)豬血液、淋巴結、脾臟、扁桃體(ti)等樣本中非洲(zhou)豬瘟病(bing)毒的檢測(ce)。

（快提核酸擴增試劑盒）

【產品名稱】

通(tong)用名稱(cheng)：非洲豬瘟試劑盒（PCR熒光探針法(fa)） 英文名稱(cheng)：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預期用途］

本試劑(ji)盒(he)主(zhu)要用于(yu)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)疑似(si)感染豬抗凝血(xue)及(ji)臨床(chuang)病(bing)(bing)料中的(de)非洲豬瘟(wen)病(bing)(bing)毒（ASFV,African Swine Fever Virus）核酸，適(shi)用于(yu)非洲豬瘟(wen)病(bing)(bing)毒的(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)、輔助(zhu)診斷和流行病(bing)(bing)學調查。

【試劑盒組分】

1、試劑(ji)盒組成及貯藏(zang)條件

2、需自備材料：生理鹽水、無菌槍頭、熒光PCR專用反應管、記號筆等。

【操作步驟(zou)】一、樣(yang)品制(zhi)備

1、血液樣品(pin)：采集(ji)抗(kang)凝血（抗(kang)凝劑為(wei)EDTA）或血清樣品(pin)，編(bian)號(hao)備用。

2、組(zu)織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴(ba)結(jie)、扁桃體(ti)等病變組(zu)織樣品或軟蜱(pi)0.1g（黃(huang)豆粒大小），眼(yan)科剪(jian)剪(jian)碎(sui)于(yu)組(zu)織勻(yun)漿(jiang)器或研缽中(zhong)充分(fen)勻(yun)漿(jiang)或研磨，再加(jia)1mL生理鹽(yan)水混勻(yun)，4°C條件(jian)下8000rpm/分(fen)鐘離心2分(fen)鐘，取上清液于(yu)滅菌離心管中(zhong)，編號備(bei)用。

二、DNA提取

取反應(ying)液(ye)A 20μL分(fen)(fen)別加入(ru)到新的1.5mL離心(xin)管，加入(ru)抗(kang)凝而或血清或組織(zhi)上清液(ye)2μL混(hun)勻，室溫（20°C左右）靜置(zhi)3分(fen)(fen)鐘(zhong)，加入(ru)反應(ying)液(ye)B 20μL,吹打混(hun)勻即可(ke)，若為抗(kang)凝全(quan)血，則需8000rpm/分(fen)(fen)鐘(zhong)再離心(xin)2分(fen)(fen)鐘(zhong)后做為待檢(jian)DNA溶液(ye)。

二、PCR擴增

1、配液：取出PCR反應(ying)液、酶混(hun)合液，在室(shi)溫完全融化后，充分混(hun)勻，瞬離，可將酶混(hun)合液全部取岀直接加入到PCR反應(ying)液中，充分混(hun)勻，瞬離后按每份(fen)20μL分裝使(shi)用(yong)；或(huo)按照每份(fen)PCR反應(ying)液17μL,酶混(hun)合液3μL的比例取一定的試驗(yan)用(yong)量，混(hun)合兩種反應(ying)液,瞬離后按照每份(fen)20μL分裝到專用(yong)熒光PCR 反應(ying)管中，剩余試劑立(li)即凍存；（操作過程要注(zhu)意避光）

2、加樣(yang)(yang)擴增：分別向上述(shu)PCR反(fan)應管中加入5μL樣(yang)(yang)本 DNA或陰性對照或陽(yang)性對照，混勻(yun)并瞬離(li),放(fang)入熒(ying)光PCR儀上運行以下程(cheng)序：

步驟 條件 循(xun)環數 UNG處理 50°C：2分(fen)鐘1 預(yu)變性(xing) 95°C：3分(fen)鐘1 預(yu)擴増 95°C：8秒55C：8秒5 PCR擴增(zeng) 95°C：8秒55°C：8秒40

熒光通道選(xuan)擇(ze)FAM,在40循環階段(duan)每(mei)個循壞的(de)55°C時收集熒光信號(hao)。設置擴增(zeng)體(ti)系為25μL,同(tong)時要選(xuan)擇(ze) passive reference 和 quencher 為 none 的(de)模式。

(注:若熒光PCR儀(如ABI7500)按說(shuo)明書(shu)中的反應(ying)程序設置后因持溫(wen)時間短無法運行,可將預(yu)擴增(zeng)和(he)PCR擴增(zeng)條件變(bian)更為(wei)95°C：5秒55°C：30秒。)

【結果判定】1、基線和閾(yu)(yu)值設(she)定；基線調整取6-15個循環的熒光信號，閾(yu)(yu)值設(she)定以閾(yu)(yu)值線剛好(hao)超過陰(yin)性對(dui)照檢測熒光曲線的最(zui)高點為原(yuan)則。

2、質量(liang)控制(zhi)：反(fan)應(ying)結(jie)束后，陰(yin)性對(dui)照的(de)檢測結(jie)果應(ying)無(wu)特定(ding)的(de)擴(kuo)增曲線，Ct值為＞38或無(wu)；陽性對(dui)照 的(de)Ct值應(ying)≤30.0,且明顯的(de)擴(kuo)增曲線；否則實驗視為無(wu)效。

3、樣品判(pan)(pan)定(ding)：待檢樣品熒(ying)光信號有指數(shu)型增加，且結果顯(xian)示Ct值<35.0,報告(gao)為(wei)(wei)(wei)陽性(xing)；未檢測(ce)到(dao)Ct 值或(huo)Ct值＞38或(huo)無明顯(xian)擴增曲線，則(ze)樣品判(pan)(pan)定(ding)為(wei)(wei)(wei)陰(yin)性(xing)。35≤Ct值≤8時，復檢一次，重復結果為(wei)(wei)(wei)陽性(xing)者判(pan)(pan)定(ding)為(wei)(wei)(wei)陽性(xing)，否則(ze)判(pan)(pan)定(ding)為(wei)(wei)(wei)陰(yin)性(xing)。

【注意事(shi)項】1、實(shi)驗前請仔細閱讀本試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明書，嚴格(ge)按照操作(zuo)步驟(zou)執(zhi)行，在操作(zuo)過程中對時間、試(shi)劑(ji)體積等(deng)精確控制可以獲(huo)得(de)最(zui)好的結果。

2、實驗室(shi)應(ying)嚴格按照有關規定分區管理。各(ge)區間(jian)人員、器材、試(shi)劑(ji)及空氣流向應(ying)有產格要求。

3、有關耗材確保潔凈、無菌(jun)，核(he)酸提取完(wan)成后盡(jin)快進入下一步試驗或(huo)冷凍保存(cun)。

4、預(yu)混后的試(shi)劑應盡(jin)量(liang)在短期內(nei)使(shi)(shi)用完畢，戶外使(shi)(shi)用應在加冰袋的泡(pao)沫盒保存，每日(ri)試(shi)驗完畢應及(ji)時冷凍保存。

5、對于熒光PCR管要避免徒手(shou)或使用過的(de)手(shou)套接觸，檢測過程中使用不(bu)帶(dai)熒光物質一(yi)次性乳膠手(shou)套。

6、凍存試劑使用前應于室溫下完全融化，充分(fen)混勻，瞬時離心使液體完全沉于管(guan)底(di)。

7、樣(yang)品、陰(yin)性對(dui)照封蓋(gai)后(hou)，在(zai)通風(feng)環(huan)境(jing)添加陽(yang)性對(dui)照并及時(shi)封蓋(gai)，避免組分間及氣(qi)溶膠等假陽(yang)性污(wu)染。

8、擴(kuo)增反應完畢后的PCR管嚴禁開蓋,應和試驗產生的其它廢棄物一起及時收集,遠離(li)PCR實驗室進(jin)行無(wu)害化(hua)處理。

【規格】50頭份/盒(he)。

【貯藏與有效期(qi)】-20°C以下避(bi)光保存，有效期(qi)12個(ge)月(yue)。

僅供獸醫診斷使用