養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒（柱膜法）使用說明書

養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒又稱環境檢測非洲豬瘟試劑盒，養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒以探針法熒光定量PCR技(ji)術(shu)為(wei)基礎(chu)開(kai)發的(de)專門檢測非洲豬(zhu)瘟(wen)病毒的(de)試劑盒(he)。

【產品名(ming)稱(cheng)】通用名(ming)稱(cheng)：病(bing)毒DNA提取試劑(ji)盒

英文名稱：Extraction Kit for Virus DNA

【預期用途(tu)】本試劑盒主要用于(yu)疑似病毒等病原感染(ran)抗凝血、血淸、拭子、組(zu)織、飼(si)料及(ji)環境中的(de)病毒DNA的(de)提(ti)取，純化的(de)核酸可適用于(yu)各(ge)種常規操(cao)作及(ji)PCR試驗。

【試劑盒組分】

I、試(shi)劑盒組成(cheng)及貯(zhu)藏條件 名稱 20T 50T

1、吸附柱 20個(ge)(ge)(ge) 50個(ge)(ge)(ge) 2、收集(ji)管 20個(ge)(ge)(ge) 50個(ge)(ge)(ge) 3、裂解液 5mL11mL4、洗(xi)液I13mL32mL5,洗(xi)液II13mL32mL6.洗(xi)脫液1.2mL3mL

2、保存條件及有效期：室溫下保存，有效期12個(ge)月.

3、需自備材料：無(wu)(wu)(wu)水乙(yi)醇、1.5mL無(wu)(wu)(wu)菌離心(xin)管、1.5mL無(wu)(wu)(wu)菌離心(xin)管（長臂型(xing)）、生(sheng)理鹽(yan)水、研缽、無(wu)(wu)(wu)菌1mL,2OOuL、10uL槍頭、記(ji)號筆等。

【操作步驟】

一、樣品制備

1、血(xue)(xue)(xue)液(ye)樣(yang)品：抗凝血(xue)(xue)(xue)樣(yang)品置(zhi)離(li)(li)(li)心管中，8000轉/分(fen)鐘(zhong)離(li)(li)(li)心2分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)層(ceng)血(xue)(xue)(xue)漿；非抗凝血(xue)(xue)(xue)樣(yang)品置(zhi)離(li)(li)(li)心管中，待(dai)凝固后(hou)，8000轉/分(fen)鐘(zhong)離(li)(li)(li)心2分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)層(ceng)血(xue)(xue)(xue)清，置(zhi)于滅菌離(li)(li)(li)心管中，編號待(dai)檢。

2、組織(zhi)樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結、扁桃體等病變組織(zhi)樣品0.1g.組織(zhi)勻(yun)漿器(qi)或研缽中充分勻(yun)漿或研磨，加入1mL生(sheng)理鹽水(shui)混勻(yun)，8000轉/分鐘離(li)心2分鐘，取上清(qing)于滅(mie)菌離(li)心骨中，編號(hao)待(dai)檢。

3、口腔液：進食前用拭子/口腔液采集(ji)袋或自制(zhi)棉(mian)線綁紗布團吸(xi)引動物咀嚼，收集(ji)口腔液大(da)于500uL，8000轉/分(fen)鐘離心2分(fen)鐘，取上清于滅(mie)菌離心管(guan)中，編號待(dai)檢。

4、飼(si)料(liao)：取適量(liang)研磨后的飼(si)料(liao)（約0.2g），放入(ru)含(han)1mL生理鹽水或PBS（PH為7.4）緩沖液的2mLEP管(guan)屮，振蕩混勻，8000轉(zhuan)/分鐘離心2分鐘，取上(shang)清于滅菌離心管(guan)中,編號待檢.

5、灰(hui)塵：用無菌棉簽蘸(zhan)取適量環境表面上的灰(hui)塵，放入含1mL生理鹽水(shui)或(huo)PBS（PH為7.4）緩沖液的2mLEP管中，振蕩(dang)混勻，8000轉(zhuan)/分(fen)鐘離心2分(fen)鐘，取上清于滅菌離心管中，編號待檢。

二、DNA的提取

1、取裂(lie)解液200uL加入(ru)無(wu)核酸酶1.5mL離(li)心(xin)(xin)曾(ceng)屮(che)，分別加入(ru)血漿(jiang)/血清(qing)(qing)/組織液等樣(yang)品(pin)液200uL.震蕩混勻10秒或顛倒(dao)混勻10次(ci)，室溫放置(zhi)5分鐘(zhong)(zhong)（如果室內溫度較低時.需放置(zhi)25C水浴(yu)溫育），再加入(ru)200uL無(wu)水乙醇，顛倒(dao)混勻10秒；若樣(yang)品(pin)渾濁則(ze)先12000轉/分鐘(zhong)(zhong)離(li)心(xin)(xin)1分鐘(zhong)(zhong)處理，取上清(qing)(qing)液，以避免(mian)堵塞柱子；

2、將液體轉入(ru)套有收集管的吸附柱中(zhong)，12000rpm離心1分鐘：

3、棄(qi)收(shou)集管液體，向(xiang)吸(xi)附柱中(zhong)加600uL洗(xi)液I,12000rpm離心1分鐘(zhong);

4、棄收(shou)集管液體，向吸附(fu)柱中加(jia)600uL洗液II，12000rpm離心I分鐘(zhong)；

5、棄(qi)收集管液體，12000rpm離(li)心2分鐘，以(yi)徹底去除殘留洗液；

6、將吸附柱轉(zhuan)入新的無核酸(suan)(suan)酸(suan)(suan)1.5mLEP管(guan)（長臂型）中(zhong)，向柱中(zhong)央滴加50uL洗脫液，靜(jing)置1分鐘,12000rpm離(li)心(xin)1分鐘，EP管(guan)中(zhong)液體即為(wei)病毒DNA。

【注意事項(xiang)】1、實(shi)驗(yan)前(qian)諾仔細閱讀(du)本試劑(ji)盒說明書，嚴格按照操(cao)作步驟執行.在操(cao)作過程中(zhong)對時間、試劑(ji)體積等粘確控(kong)制可以(yi)獲得(de)最好的結果

2,樣本應新鮮采集(ji)使用，或低溫運輸儲(chu)存；

3,樣本具有潛在(zai)(zai)感(gan)染風險，核酸的提(ti)取(qu)應在(zai)(zai)核酸提(ti)取(qu)實驗室的生物安(an)全柜(ju)中進行。

4、核酸提(ti)取冇(mao)關耗材確保(bao)(bao)高溫滅菌，提(ti)取后核酸盡快進入下(xia)一步試(shi)驗或(huo)冷凍保(bao)(bao)存待用。

5,試劑使用(yong)前應混合均勻(yun)，試劑具有一定腐蝕性，使用(yong)時請戴手套、口罩(zhao)做(zuo)好防護(hu)。

6.低溫(wen)下裂解液出現結晶數屬正常現象(xiang)，可在60°C水(shui)浴加(jia)熱(re)助溶后使用。

7、實(shi)驗產生的廢棄物應及時(shi)收集，遠離PCR實(shi)驗室進行無害化處理(li)。

僅供獸醫診斷使用

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測(ce)試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)【獸藥(yao)名稱】

通用名稱：非洲(zhou)豬瘟病毒(du)熒光PCR核酸檢測(ce)試劑盒

漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名稱：無

【主要(yao)成分(fen)與含(han)量】試(shi)(shi)劑盒(he)中含(han)有如下組(zu)分(fen):試(shi)(shi)劑盒(he)組(zu)分(fen)含(han)量，陽性對照250μL/管(guan)×1管(guan)，陰性對照250μL/管(guan)×1管(guan)，PCR反應液850μL/管(guan)×1管(guan)，萌(meng)混合(he)液150μL/管(guan)×1管(guan)，說明(ming)書1份/盒(he)

【作用與用途(tu)】本試劑盒可用于血液(ye)、脾臟(zang)、肝臟(zang)、淋巴(ba)結、樣品中非洲(zhou)豬瘟病毒核酸的檢測。扁(bian)桃體、腎臟(zang)、肌肉、環(huan)境樣品等

【用法與判定】

1用法

1.1待檢樣品(pin)釆集(ji)、保存及運輸

1.1.1樣品釆集

（1）活豬(zhu)樣品 無(wu)菌采(cai)集抗凝血或血清5mL

（2）病(bing)死豬剖(pou)(pou)檢樣(yang)(yang)品(pin)或屠宰場剖(pou)(pou)檢樣(yang)(yang)品(pin)，無菌(jun)采集死豬的牌、肺、腎、扁桃(tao)體(ti)、淋巴(ba)結(jie)、肌肉等組織樣(yang)(yang)品(pin)。2?8°C低溫(wen)運至實驗室用(yong)于(yu)檢測。

（3）病(bing)豬污染的(de)(de)周邊環境 采集與病(bing)豬相關場所的(de)(de)糞便、飼料、污水樣(yang)品。2?8°C低溫運(yun)至實驗室(shi)用于檢測。

1.1.2樣品保存

采集的樣(yang)品在(zai)2?8°C保(bao)存應不超過24小時，-70°C條(tiao)件下保(bao)存，避免(mian)反(fan)復凍(dong)融。

1.1.3樣品運輸

泡沫(mo)箱加(jia)冰袋后密(mi)封進行運(yun)輸(shu)。包(bao)裝和(he)運(yun)輸(shu)應符合農業農村部《高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣品(pin)運(yun)輸(shu)包(bao)裝規范》和(he)交通運(yun)輸(shu)部門關于危(wei)險(xian)品(pin)運(yun)輸(shu)管理的(de)有關規定。

1.2樣品處理

1.2.1血液樣品(pin)處理

抗凝(ning)(ning)血(xue)樣品置(zhi)于(yu)離(li)(li)心(xin)管中，8000r/min離(li)(li)心(xin)2分鐘(zhong)取(qu)上層血(xue)漿，編號(hao)待檢。非抗凝(ning)(ning)血(xue)樣品置(zhi)于(yu)離(li)(li)心(xin)管中，待凝(ning)(ning)固后，8000r/min離(li)(li)心(xin)2分鐘(zhong)取(qu)200μL上層血(xue)清，編號(hao)待檢。

1.2.2組織樣品處理

取(qu)(qu)適(shi)量(liang)脾臟、肝臟、淋巴(ba)結、扁桃(tao)體、肌肉等組織(zhi)，置于研磨器或研磨管中研磨，再加(jia)適(shi)量(liang)生理鹽(yan)水混勻，制成約10%的組織(zhi)勻漿，8000r/min離心2分鐘，取(qu)(qu)200μL上 清(qing)于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號備用。

1.2.3環境樣(yang)品處理(li)

1.2.3.1糞便、飼料樣品處理(li)方法

取適(shi)量的糞(fen)便、飼料放(fang)入盛有PBS緩沖液(ye)的研磨管中(zhong)研磨混勻，制(zhi)成約10%的勻漿液(ye).8000r/min離(li)(li)心2分(fen)鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無(wu)菌離(li)(li)心管中(zhong)，編號備用。

1.2.3.2污水樣品處理(li)方(fang)法

直(zhi)接取(qu)200μL污(wu)水進行(xing)核酸提取(qu)。

1.3病毒核(he)(he)酸(suan)的提(ti)(ti)取(qu)用磁珠(zhu)法或柱式(shi)法進(jin)行(xing)DNA核(he)(he)酸(suan)提(ti)(ti)取(qu)。

1.4熒光(guang)PCR反應：

1.4.1從試劑(ji)盒中取(qu)出熒光PCR反(fan)(fan)應液、酶混合液，室溫融化后，2000r/min離心(xin)5秒。設被(bei)檢樣品、陽性(xing)對(dui)照和陰性(xing)對(dui)照總和為n,則反(fan)(fan)應體系配制如下：

試劑體系

PCR 反應液17× (n+1) μL

酶混合液3× (n+1) μL

1.4.2在(zai)新的RNase/DNase-fire1.5mL離心管(guan)中加入上述(shu)試(shi)劑(ji)，充分(fen)(fen)混勻后瞬(shun)時離心。按照20μL/管(guan)分(fen)(fen)裝(zhuang)量將試(shi)劑(ji)分(fen)(fen)裝(zhuang)至熒光PCR反應(ying)管(guan)。

1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應管蓋，混勻后瞬時離心，轉移到熒光PCR儀器 上。

144將PCR反應(ying)管放(fang)置(zhi)在熒光PCR儀樣(yang)品槽中，在熒光PCR儀上運(yun)行以下(xia)程序：

步驟(zou) 條件 循環數 UNG處理 50℃,2分鐘1 預(yu)變(bian)性 95℃,3分鐘1 預(yu)擴增 95℃：8秒55℃：8秒5 PCR擴増 95℃：8秒55℃：8秒40

熒(ying)光(guang)通道選擇FAM,在PCR擴增(zeng)(zeng)階段(duan)每個循環的55℃時(shi)(shi)采集熒(ying)光(guang)信號。設置(zhi)擴增(zeng)(zeng)體(ti)系為(wei)25μL,同(tong)時(shi)(shi)要選擇passive reference和quencher為(wei)none的模式。（注(zhu)：若熒(ying)光(guang)PCR儀（如AB17500）按說明 書中的反應(ying)程序設置(zhi)后(hou)因持溫時(shi)(shi)間短無法運行，可(ke)將預擴增(zeng)(zeng)和PCR擴增(zeng)(zeng)條件變更為(wei)95C：5秒(miao)55°C：30秒(miao)）

2結果判定

2.1試驗有效性(xing)判定

陽性對照有典型擴增(zeng)曲(qu)線(xian)且Ct值(zhi)≤30.且陰(yin)性對照無(wu)Cl值(zhi)或(huo)無(wu)擴增(zeng)曲(qu)線(xian)，線(xian)形為直線(xian)或(huo)輕微斜線(xian)，無(wu)指數增(zeng)長期。則判試驗結果有效。否則，此次試驗視為無(wu)效。

2.2樣品判定

2.2.1陽性：樣本檢測結果Ct值≤35且有(you)明顯指(zhi)數增長(chang)期(qi)，判(pan)定檢出非洲(zhou)豬瘟病毒核酸。

2.2.2可(ke)疑：樣本檢測(ce)結果Ct值(zhi)在(zai)35?38范(fan)(fan)圍內。此(ci)時應對樣本進行重(zhong)復(fu)檢測(ce)，如果重(zhong)復(fu)實驗(yan)結果Ct值(zhi)仍在(zai)35?38范(fan)(fan)圍內，有明顯指數(shu)增長期.則判定為陽(yang)性，否則為陰性。

2.2.3陰性：樣本檢測結果Ct值＞38或無Ct值，判定未檢出(chu)非洲豬瘟病(bing)毒(du)核酸。

【注意事(shi)項】（1）實驗前請(qing)仔細閱讀本試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)，嚴(yan)格按照操(cao)作步驟執行，在操(cao)作過程(cheng)中對時間、試(shi)劑(ji)(ji)體積等精(jing)確控(kong)制可以獲(huo)得最(zui)好(hao)的結(jie)果。

（2）實驗(yan)室應嚴格(ge)(ge)按照(zhao)有(you)(you)關規定分(fen)區管理，依(yi)照(zhao)配液(ye)區-模板(ban)提取區-擴增(zeng)區-分(fen)析區順序進行基(ji)因(yin)檢(jian)測。各區間(jian)人員、器材、試(shi)劑及空氣(qi)流向(xiang)應有(you)(you)嚴格(ge)(ge)要求(qiu)。

（3）核酸提(ti)取有(you)關耗村確保潔凈(jing)、無DNase/RNase,提(ti)取過程盡量低溫(wen)、快(kuai)速，完成(cheng)后進(jin)入下一步實(shi)驗(yan)或凍保。

（4）對于(yu)頂部采光儀器要帶新(xin)的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于(yu)底部采光儀

器要避免徒手(shou)或使(shi)(shi)用過的手(shou)套接觸熒光(guang)(guang)PCR管(guan)底，檢測過程(cheng)中使(shi)(shi)用不帶熒光(guang)(guang)物質(zhi)一次性乳(ru)膠手(shou)套。

（5）凍存(cun)試劑使用前應于室溫下完全融化，瞬(shun)時離心使液體(ti)完全沉(chen)于管(guan)底。避免反(fan)復凍融，以(yi)免影(ying)響試劑性能。

（6）樣品、陽性對照等在使用后及時封(feng)蓋(gai)，.避(bi)免組(zu)分間(jian)及氣溶(rong)膠等的污染(ran)造(zao)成假陽性。

（7）擴(kuo)增產物禁止開蓋，實驗(yan)產生的(de)廢(fei)棄(qi)物應(ying)及時收集，遠離PCR實驗(yan)室(shi)進行(xing)無害化處理。

【規格】50頭份/盒

【貯藏與有效期(qi)】試劑(ji)盒置-20°C以下避(bi)光保存，有效期(qi)12個月。

【批(pi)準文號】獸藥生字163668871

僅供獸醫診斷使用